Революционная рентгеноаналитическая техника, которая позволяет исследователям с первого взгляда определять структурные сходства и различия между несколькими белками в различных условиях, была разработана исследователями совместно с Лоуренсом Беркли из Министерства энергетики США (DOE). Национальная лаборатория (Berkeley Lab). В качестве демонстрации исследователи использовали эту технику, чтобы получить новое ценное представление о белке, который является основной мишенью для химиотерапии рака.
«Белки и другие биологические макромолекулы - это движущиеся машины, мощность которых часто зависит от того, как их структурные конформации меняются в ответ на окружающую среду», - говорит Грег Хура, ученый из отдела физических биологических наук лаборатории Беркли.«Знание того, что вызывает изменение белка, имеет невероятную ценность, так же как и знание того, что нажатие на педаль газа заставляет колеса автомобиля вращаться».
Хура руководил разработкой так называемой карты структурного сравнения для использования с малоугловым рассеянием рентгеновских лучей (SAXS), методом визуализации для получения структурной информации о белках и белковых комплексах в растворе. Синтия МакМюррей, биолог из отдела естественных наук лаборатории Беркли, предоставила связанный с раком белок, который использовался для тестирования новой сравнительной карты структур SAXS.
Говорит МакМюррей: «В биологии первым шагом в исправлении проблемы, такой как образование ракового поражения, является понимание условий, при которых возникла проблема. С картой структурного сравнения SAXS мы можем сравнивать множественные белковых структур в массовом порядке и быстро определить интересующие области».
Greg Hura, Helen Budworth и Cynthia McMurray, показанные здесь в Advanced Light Source, разработали карту структурного сравнения для визуализации SAXS и протестировали ее на химиотерапевтическом целевом белке. (Фото Роя Кальчмидта, Berkeley Lab)
Хура - ведущий автор, а МакМюррей - один из двух соответствующих авторов статьи в журнале Nature Methods, в которой описывается это исследование. Статья называется «Комплексные объективные карты конформаций макромолекул с помощью количественного анализа SAXS». Также автором-корреспондентом является Джон Тайнер, который работает по совместительству с отделом наук о жизни лаборатории Беркли и Исследовательским институтом Скриппса. Другими авторами являются Хелен Бадворт, Кевин Дайер, Роберт Рэмбо и Михал Хэммел.
Возможно, ни в какой другой области науки принцип «функция следует за формой» не является более верным, чем в отношении белков и белковых комплексов. Структурные конформации, создаваемые складыванием, скручиванием и поворотом аминокислотной цепи белка, могут позволить или помешать белку делать то, что он должен делать, и это может означать разницу между здоровой и нездоровой клеткой. Белок может принимать несколько различных конформационных состояний, поскольку он подвергается различным химическим процессам, таким как фосфорилирование, связывание нуклеотидов или лигандов, гидролиз АТФ или образование комплексов.
Наиболее широко используемым методом определения структуры белка остается кристаллография, но многие белки и белковые комплексы не могут быть кристаллизованы. Кроме того, хотя и точная, кристаллография является процессом с низкой пропускной способностью, который может зафиксировать только одно конформационное состояние за раз. Войдите в SAXS, высокопроизводительный метод, который может отображать любой белок или белковый комплекс в растворе при любых условиях и обеспечивает наноразмерное разрешение для различения и характеристики различных конформационных состояний, которые могут принимать гибкие биологические макромолекулы, такие как белки.
«Для SAXS существует относительно мало ограничений по условиям, конструкции, концентрации или химическому составу раствора», - говорит Хура. «Однако аналитические методы не поспевают за аппаратным обеспечением. Хотя существует множество факторов, которые могут вызвать структурные изменения белка, эти факторы трудно предсказать. Наша методика карт структурного сравнения дает нам возможность высокопроизводительного скрининга. Комбинация SAXS и наших карт позволяет нам выделить те факторы, которые имеют наибольшее значение в структурных конформациях. Мы также можем отслеживать тенденции и определять промежуточные состояния и другие факторы, которые смещают равновесие от одной структуры к другой».
Данные на карте структурного сравнения представлены в виде цветной шахматной доски с показателями сходства, отображаемыми в виде градиентов от красного, указывающего на высокий уровень, до белого, указывающего на низкий уровень, и различных оттенков оранжевого и желтого в между.
«С картами структурного сравнения я могу сразу увидеть, какие структуры и при каких условиях совпадают, а какие нет», - говорит МакМюррей. «Карты предоставляют как структурную, так и химическую информацию и позволяют нам идентифицировать те конформации, на которые нам следует обратить внимание».
Чтобы протестировать технику карты структурной конформации, соавтор Бадворт, член исследовательской группы МакМюррея, подготовил образцы белка, известного как MutSß, привлекательную химиотерапевтическую мишень из-за его способности удалять проблемную ДНК, которая может привести к рак и другие генетические мутации.
«MutSß представляет собой гетеродимер, две макромолекулы которого проходят упорядоченную серию нуклеотидно-зависимых шагов, чтобы инициировать репарацию ДНК», - говорит Бадворт. «Каждое дискретное состояние, связанное с нуклеотидом, является точкой принятия решения о конформационном состоянии, которая запускает следующий этап пути. Механическое понимание этих этапов имеет решающее значение для изучения того, как клетки избегают мутации».
Говорит МакМюррей: «Изначально это было очень большой загадкой, потому что у MutSß не было кристаллической структуры, и мы не могли взглянуть на какое-либо одно конформационное состояние и сказать, хорошо это или плохо. Структурные карты конформации позволили нам чтобы охарактеризовать различные конформационные состояния по отдельности, а затем сравнить их друг с другом. Мы обнаружили, что ДНК на удивление мало влияет на конформационные структуры MutSß, факт, который не был очевиден из биохимических измерений, но очевиден при изучении карт».
Исходя из визуализации SAXS и анализа карты структурной конформации, МакМюррей и ее группа пришли к выводу, что ДНК формируется в соответствии с конформацией белка и что связывание нуклеотидов вызывает конформационные изменения MutSß. Это, по их словам, имеет значение для будущих методов лечения рака.
Образцы MutSß были подвергнуты SAXS на линии луча SIBYLS усовершенствованного источника света Berkeley Lab, синхротрона, который генерирует лучшие лучи рентгеновского и ультрафиолетового света для научных исследований. Аббревиатура SIBYLS расшифровывается как Structurally Integrated Biology for Life Sciences. Линия луча поддерживается отделом естественных наук лаборатории Беркли под руководством соответствующего автора Тайнера.
Тайнер говорит: «Техника структурных сравнительных карт - это большой шаг вперед в разработке инструментов, которые помогут биологам использовать весь потенциал потрясающей пропускной способности, которую мы ожидаем достичь с помощью следующего поколения источников света».