Более половины всех белков человека, а также многие важные фармацевтические средства являются гликопротеинами, а это значит, что они содержат сахарные компоненты. В общем, природные гликопротеины не имеют гомогенного сахарного компонента.
С помощью современных методов очистки практически невозможно выделить достаточное количество гомогенных гликопротеинов для систематических биомедицинских исследований. Синтез в лаборатории - хорошая альтернатива, но и очень сложная задача. Как сообщают в журнале Angewandte Chemie, ученые под руководством Карло Унверзагта из Университета Байройта (Германия) успешно использовали новую стратегию для синтеза рибонуклеазы С (РНКазы С), гликозилированного фермента бычьей поджелудочной железы.
Компоненты сахара играют важную роль в растворимости в воде, стабильности и сворачивании гликопротеинов. Кроме того, они участвуют в процессах молекулярного распознавания, таких как клеточная адгезия или взаимодействие клеток-хозяев с патогенами. Таким образом, один и тот же белок с разными остатками сахара может иметь разные функции. РНКаза представляет собой фермент, который встречается в различных гликозилированных формах. Поскольку этот фермент интенсивно изучался ранее, он представляет собой интересную модельную систему для исследований. РНКаза С содержит сложный сахарный компонент в виде двусторонней «антенны».
Традиционный твердофазный синтез, используемый для создания пептидов по одной аминокислоте за раз, слишком сложен для длинных пептидных цепей, а иногда вообще не работает из-за побочных реакций. Таким образом, Унверзагт и его команда построили РНКазу С последовательно из нескольких фрагментов, соединив их с помощью «нативного химического лигирования». В этом методе один пептидный фрагмент присоединяется к концевой цистеиновой группе (серосодержащей аминокислоте) второго пептидного фрагмента с помощью тиоэфирной группы - селективная реакция, которая приводит к естественной пептидной связи.
Исследователи использовали твердофазный синтез, чтобы получить важный фрагмент пептида, который имеет сахарную антенну. Другой фрагмент был получен бактериально с помощью метода, основанного на сплайсинге белков. В этом процессе белковая последовательность (интеин) автокаталитически отщепляется от слитого белка, генерируемого в клеточной культуре. Сложность: кроме терминальной цистеиновой группы этот фрагмент белка содержит семь дополнительных цистеинов. Их сероводородные группы чрезвычайно реакционноспособны и чувствительны к окислению. Чтобы защитить их, они были «запечатаны» как смешанные дисульфиды. Эти защитные группы впоследствии можно было легко удалить.
Благодаря сложным методам команда наконец смогла правильно прикрепить отдельные фрагменты, свернуть фермент в его естественную форму и правильно соединить цистеины в дисульфидные мостики, чтобы сформировать функциональную РНКазу C.