Антитела плохого мальчика
Биологические исследования немыслимы без антител, но и они дают много неверных данных. Это должно измениться.
В 2006 году успех Дэвида Римма казался вполне достижимым. Патолог из Йельского университета в Нью-Хейвене, штат Коннектикут, только что разработал прогностический тест для лечения рака кожи, который должен был спасать жизни. Тест был основан на антителах - тех больших белках Y-образной формы, которые специфически связываются с биомолекулами и, таким образом, идентифицируют их. Теперь Римм идентифицировал комбинацию антител, с помощью которых он мог окрашивать биоптаты опухолей. Он хотел использовать окрашивание, чтобы предсказать, потребуется ли пациенту специальное, более агрессивное лекарство для предотвращения рецидива, то есть рецидива опухоли. Римм получил более двух миллионов долларов США на финансирование проекта и хотел продолжить разработку теста для клинического использования.
Но спустя три года возникли первые трудности, когда он уже не смог воспроизвести прежние результаты с новым набором антител. Хотя новая партия реагентов была продана той же компанией и должна была быть идентична старой, исследователи просто не получили такой же картины окрашивания даже на образцах опухолей, которые они изучали ранее. В конце концов, Римму даже пришлось отказаться от работы над набором специфичных для меланомы антител. «Нам нужно было усвоить урок: никогда не зависеть от определенных реагентов», - говорит он сегодня. «Это было действительно удручающее лабораторное совещание».
Антитела - один из самых распространенных инструментов в науках о жизни, так называемые инструменты, с помощью которых можно идентифицировать и выделять самые разнообразные молекулы. Тем не менее, они также являются наиболее распространенной причиной проблем. Как и в случае Римма, изменчивость от партии к партии может привести к различным результатам или, что еще более проблематично, неожиданное связывание с дополнительными белками может вызвать трудности. Целые проекты останавливаются, а время, деньги и пробный материал тратятся впустую.
Многие винят антитела в так называемом «кризисе воспроизводимости» исследований. Становится все более очевидным, что ряд результатов биомедицинских экспериментов невозможно повторить и что сделанные выводы могут быть основаны на неверных предположениях. Плохо охарактеризованные антитела, вероятно, внесут больший вклад, чем другие инструменты, говорит Гленн Бегли, главный научный сотрудник Tetra Logic Pharmaceuticals в Малверне, штат Пенсильвания. Он также является автором горячо обсуждаемого комментария по поводу отсутствия воспроизводимости данных из 47 из 53 важных публикаций по исследованию рака.
Другие обожженные дети с плохим опытом теперь постепенно заявляют о себе. После своего разочарования Римм также пытался предупредить других ученых; он пишет обзоры, организует вебинары и поднимает проблему на бесчисленных конференциях. Вместе со своими коллегами он хотел бы создать стандарт производства, использования и описания антител - и на самом деле что-то произошло в направлении контроля качества.
Но о реальном движении говорить пока рано. «Есть уже много возможностей, но никто ими не пользуется, а многие даже не знают о них», - сказал Лен Фридман, директор Института глобальных биологических стандартов в Вашингтоне, округ Колумбия, некоммерческой организации, которая работает над улучшением биомедицинских исследований. «Большинство производителей не видят смысла вносить какие-либо изменения, хотя многие антитела просто бесполезны."
Покупатели, будьте осторожны
Давайте возьмем Иоанниса Прассаса, исследователя протеома из больницы Mount Sinai в Торонто, Канада, который хочет использовать белок CUZD1 для обнаружения карциномы поджелудочной железы (рака поджелудочной железы). Его сотрудники купили набор для обнаружения и потратили впустую два года, 500 000 долларов и тысячи образцов пациентов, прежде чем поняли, что антитело в наборе связывается вовсе не с CUZD1, а с совершенно другим белком, называемым CA125. Теперь он знает, что вся работа над многообещающей гипотезой в конечном итоге провалилась из-за подходящих проверок. «Когда кто-то рекомендует вам анализ, вы прыгаете в него, совершенно не подозревая, что все обещания могут быть неправдой».
Большинство ученых просто верят тому, что написано на этикетке пробирки, когда покупают антитела, объясняет Римм. «Как патологоанатом меня не учили сначала проверять, действительно ли антитело распознает то, что, по его словам, оно делает. Мне только показали, как его заказать."
Иммунная система большинства позвоночных вырабатывает антитела для устранения захватчиков, таких как бактерии; с 1970-х годов молекулы также использовались наукой. Когда кролику вводят белок, некоторые из его лейкоцитов, называемые В-клетками, вырабатывают к нему антитела, которые затем можно выделить из крови животного. Чтобы получить более однородные антитела, В-клетки также можно сначала собрать из крови, слить с иммортализованными клетками и культивировать, чтобы затем, по крайней мере теоретически, получить бесконечное количество идентичных антител.
30 лет назад ученые все еще должны были сами производить антитела, необходимые для своих экспериментов - с конца 1990-х годов эту работу за них делали многочисленные компании.
По данным международной консалтинговой фирмы Frost & Sullivan, сегодня более 300 компаний производят более двух миллионов антител для исследований, рыночная стоимость которых в 2011 году составила 1,6 миллиарда долларов.
Разрушительные эффекты
Но появляется все больше свидетельств того, что проблемы с антителами могут иметь далеко идущие и, возможно, разрушительные последствия для исследований. В 2009 году целый выпуск журнала был посвящен антителам, используемым при изучении рецепторов, связанных с G-белком (GPCR). Это важные клеточные сигнальные белки, которые рассматриваются в качестве мишеней для новых методов лечения заболеваний, начиная от недержания мочи и заканчивая шизофренией. Большинство из 49 коммерчески доступных антител против 19 различных рецепторов, которые были исследованы, связывались более чем с одним белком, так что в конечном итоге рецепторы нельзя было четко различить.
Эпигенетика также сильно зависит от антител при исследовании модификации белков и их влияния на регуляцию генов. Согласно анализу 246 использованных здесь антител, опубликованному в 2011 г., четверть из них были неспецифическими и связывались более чем с одним белком-мишенью. Хотя четыре из исследованных антител были очень специфичны, они, к сожалению, не связывались с указанной молекулой-мишенью.
Среди ученых часто ходят слухи о том, какие реагенты являются проблематичными, но масштабы трудностей в биологии до сих пор не были ясны. Возможно, наиболее полная оценка содержится в публикации шведского консорциума Human Protein Atlas, целью которого является производство антител против любого человеческого белка. Из исследованных на сегодняшний день коммерческих антител, около 20 000, менее половины смогли продемонстрировать распределение белка в фиксированных срезах ткани. Вот почему некоторые исследователи сейчас говорят, что почти каждое второе коммерчески доступное антитело не заслуживает доверия.
Но надежность реагентов также может зависеть от типа эксперимента. «По нашему опыту, имеющиеся в продаже антитела хорошо подходят для одних методов, но совершенно бесполезны для других», - говорит Матиас Улен из Королевского технологического института в Стокгольме, который координирует там работу над Атласом белков человека.
"Антитела не волшебники!"(Джеймс Триммер)
Перед началом своих экспериментов исследователи должны сначала проверить, действительно ли предполагаемое антитело было протестировано для желаемого метода и исследуемой ткани. Однако информация об этом сильно разнится от компании к компании, и многие ученые жалуются, что некоторые компании вообще не предоставляют данные о специфичности или изменчивости партии. Иногда также поставляются антитела с информацией о старых партиях, которые зачастую были собраны в идеальных условиях, не соответствующих типичной ситуации в лаборатории. Опрошенные производители возразили, что они не могут протестировать всю свою продукцию в каких-либо экспериментальных условиях; однако предоставленные данные надежны, а качество антител постоянно улучшается в сотрудничестве с учеными.
Многие исследователи теперь используют Google для выбора необходимых реагентов. Это может означать, что компании больше заинтересованы в стратегиях обнаружения в Интернете, чем в оптимизации своих реагентов, говорит Тим Бернард, глава консалтинговой компании Pivotal Scientific в Аппер-Хейфорде, Великобритания. Как аналитик из Вашингтона, округ Колумбия, Кристи Берд из Frost & Sullivan считает, что ученые часто больше заинтересованы в быстрой доставке, чем в подходящих данных проверки антител. «Это как Amazon: все хотят, чтобы антитела были доставлены в течение двух-трех дней и желательно с бесплатной доставкой».
Кто знаком с проблемой антител, советует быть осторожнее. «Антитела не волшебники. Вы не можете просто протестировать их и ожидать 100% надежного результата без критического анализа данных», - говорит Джеймс Триммер. Он руководит компанией NeuroMab в Калифорнийском университете в Дэвисе, которая производит антитела для нейробиологии и, как и многие другие компании, прямо указывает методы, для которых можно использовать их продукты, но исследователи не всегда придерживаются этого.
В идеале исследователи не должны приобретать антитела, для которых нет подробных данных проверки или если они не собираются собирать их самостоятельно (см. «Плохие антитела»). Римм считает это чрезвычайно важным и поэтому опубликовал многоступенчатую модель эффективной проверки, которую он с удовольствием объяснит всем, кто заинтересован. Однако реализация требует чрезвычайно много времени и включает, например, контрольные эксперименты, для которых сначала необходимо создать клеточные линии с контролируемой экспрессией соответствующего белка. Несмотря на весь свой энтузиазм, Римм понимает, что немногие лаборатории пройдут все этапы.
Некоторые ученые сначала покупают несколько антител от разных компаний и проверяют, какие из них лучше всего подходят для них в лаборатории. Одно и то же антитело может потом встречаться несколько раз, потому что крупные компании часто дополняют свой ассортимент, торгуя реагентами от более мелких производителей, и меняют только этикетку на пробирке. По словам Бернарда, из двух миллионов антител, представленных на рынке, только от 250 000 до 500 000 действительно отличаются.
Так много исследователей неизбежно полагаются на сарафанное радио или сверяются с публикациями, поэтому, конечно, одни и те же антитела используются снова и снова, а лучшие реагенты, разработанные позже, используются редко, объясняет протеомист университета Фритьоф Лунд-Йохансен Осло. «В продаже есть очень хорошие антитела, но о них никто не знает», - добавляет он. Поэтому Лунд-Йохансен хочет разработать высокопроизводительные анализы, в которых можно было бы одновременно напрямую сравнивать тысячи антител.
Время тестирования на антитела
В последнее десятилетие появились различные проекты, направленные на то, чтобы сделать информацию об антителах более доступной. Онлайн-портал реагентов Antibodypedia Консорциума белков человека каталогизировал более 1,8 миллиона антител и оценил данные проверки для использования в различных методах. В течение последних двух лет портал «Антитела-онлайн» предлагает программу, позволяющую независимым лабораториям проводить собственные валидационные исследования, как правило, за счет производителя. На сегодняшний день в 275 исследованиях только половина всех продуктов достигла требуемого уровня и получила награду «независимая проверка». Есть и другие подходы. Некоммерческая организация Antibody Registry присваивает антителам уникальные имена и связывает их с другими источниками, а pAbmAbs работает аналогично порталу рекомендаций Yelp и призывает исследователей представить свою собственную оценку.
До сих пор, однако, ни один из подходов не смог реально зарекомендовать себя; многие из опрошенных нами исследователей даже не знали об этом. Рынок антител сейчас настолько переполнен, что хорошая репутация производителя качественных товаров является частью бизнес-плана некоторых компаний. «При такой высокой конкуренции компаниям приходится специализироваться, - говорит Бернард. Такие компании, как Abcam в Кембридже, Великобритания, поощряют своих клиентов размещать свои собственные данные и отзывы на веб-сайте компании. Abcam также проанализировала поведение клиентов и обнаружила, что среднее количество посещений веб-сайта до совершения покупки равно девяти, что указывает на то, что клиенты хотят получать более качественную информацию.
Компания Abgent из Сан-Диего, штат Калифорния, и ее дочерняя компания WuXi AppTec в Шанхае, Китай, в течение года тестировали все свои антитела и, изучив результаты, удалили около трети из них из каталога. Было ли это правильным решением, будет зависеть от готовности клиентов тратить больше денег на более качественные реагенты, говорит местный менеджер Джон Монцурис. По крайней мере, с тех пор жалоб от клиентов не поступало.
Некоторые ученые хотят радикальных изменений в бизнесе. В феврале Эндрю Брэдбери из Лос-Аламосской национальной лаборатории в Нью-Мексико вместе с более чем 100 соавторами в Nature выступил за массовый сдвиг в производстве и коммерциализации антител. Они рекомендовали использовать только те антитела, которые были охарактеризованы до базовой последовательности ДНК и произведены в специально созданных рекомбинантных клетках. Это, по крайней мере, позволило бы избежать большей части изменчивости, возникающей в результате производства только у животных. Но для этого потребуется доступ к информации, которую многие компании считают коммерческой тайной, и потребуется полная перестройка рынка антител с его миллионами продуктов.
Улен, один из соавторов комментария, считает этот план благородной целью. По его мнению, метод производства, который Брэдбери хочет производить рекомбинантными антителами, стоит в 10-100 раз дороже, чем предыдущие методы производства, и не обязательно должен производить более качественные антитела. «В конечном счете важно, работает ли антитело в приложении», - говорит он. «Даже последовательность ДНК ничего не говорит об этом заранее». Другие усилия направлены на поиск быстрых и более надежных путей производства антител без иммунизации животных, например, путем экспрессии и оптимизации в вирусах.
Требование охарактеризовать имеющиеся в настоящее время продукты постепенно растет. Чтобы улучшить воспроизводимость данных исследований, ученые обсуждают независимую панель и программу сертификации коммерчески доступных антител. Несколько журналов (в том числе «Nature») теперь также требуют от своих авторов заявления о том, что используемые антитела были протестированы для использования в специальном методе.
Но качество будет улучшаться очень медленно, говорит Триммер и надеется на положительную обратную связь: если исследователи узнают об артефактах от других, они с большей вероятностью будут подвергать сомнению свои собственные результаты и, возможно, обнаруживать больше несоответствий. Ведь ранее широко распространенное отсутствие заботы об используемых антителах уменьшилось. «Что-то происходит», - говорит он. «Мы должны оставаться на высоте».