Отдельные молекулы и их динамика также могут быть видны в живых клетках с помощью обычных флуоресцентных красителей с разрешением около 20 нанометров. Международная группа ученых впервые показывает, как это делается, в журнале Nature Methods.
Что происходит в клетке между молекулами, как сделать видимыми эти процессы? Этим вопросом занимается команда профессора Маркуса Зауэра в Биоцентре Вюрцбургского университета. Исследователи полагаются на новейшие методы флуоресцентной микроскопии, которые характеризуются высоким временным и пространственным разрешением.
Как работает флуоресцентная микроскопия? Проще говоря: ДНК, белки или другие молекулы в клетке маркируются флуоресцентными красителями. Если затем клетку «бомбардировать» лазерными импульсами, помеченные молекулы ненадолго загораются. Их флуоресцентный сигнал, так сказать, «световое эхо», можно сделать видимым с помощью технических приемов.
Размытое пятно света
Любой, кто хочет получить изображение многих отдельных белков с помощью флуоресцентного микроскопа, например, сталкивается с проблемой: если все белки в клетке загораются одновременно, в них появляется только расплывчатое пятно света. микроскоп. Причина: белки расположены слишком близко друг к другу, их световые сигналы перекрываются - как на круизном лайнере, где свет горит во всех каютах. На слишком большом расстоянии глаз видит только одно пятно света.
Но если бы огни на борту включались индивидуально и только на короткое время, положение каждой каюты можно было бы точно определить. «Если корабль движется, это должно происходить, конечно, быстро, чтобы световые сигналы не стирались», - говорит Зауэр.
Живые клетки можно исследовать с помощью обычных красителей
Команда из Вюрцбурга использует именно эту стратегию - с флуоресцентными красителями, которые можно включать и выключать световыми сигналами, которые исследователи называют «оптически переключаемыми». Это приводит к значительно более четким изображениям состояний в ячейке.
Однако оптически переключаемые флуоресцентные красители не работают в живых клетках, потому что мешает присутствие кислорода - по крайней мере, таково было преобладающее научное мнение. Но команда Зауэра вместе с коллегами из Билефельда и Нью-Йорка впервые показала, что дело обстоит наоборот: «Мы выяснили механизм и знаем, что он работает и в живых клетках.“
Визуализация сверхвысокого разрешения
Как выглядит этот механизм? Клетки содержат глутатион, который переводит большинство коммерчески доступных оптически переключаемых красителей в стабильное выключенное состояние, продолжающееся несколько секунд после лазерного возбуждения. При этом происходит реакция с кислородом, которая снова включает красители, но очень неэффективно.
«Поэтому большинство молекул красителя постоянно отключены, а это именно то, что требуется для работы изображений сверхвысокого разрешения», - объясняет Зауэр.
Гистоны, отмеченные в ядре клетки
Ученые демонстрируют свою методологию в «Природных методах» на гистонах живых клеток человека. Гистоны - это белки, которые используются для упаковки ДНК в ядре клетки для экономии места. Существует пять различных гистонов, исследователи работали с вариантом 2B.
Сначала такие гистоны соединили с бактериальным ферментом - дегидрофолатредуктазой. Затем они добавили флуоресцентный краситель, который ранее присоединили к антибиотику триметоприму. Хитрость: антибиотик очень специфически связывается с ферментом, и гистоны типа 2B могут быть помечены красителями через этот импровизированный мостик.
Следующий шаг: наблюдение за делением клеток
Используя этот метод, исследователи подтвердили уже известный факт: ДНК, упакованная гистонами, движется в ядре клетки со скоростью несколько нанометров в секунду, в зависимости от фазы клеточного цикла.. Зауэр: «Следующий шаг - проследить процесс клеточного деления в высоком разрешении под микроскопом».