Обмен веществом и информацией на уровне отдельных клеток требует транспорта и передачи сигналов на уровне плазматической мембраны, окружающей клетку. Изучение механизмов в таких крошечных размерах ставит перед исследователями огромные задачи - например, когда они хотят выяснить, как ведет себя и распределяется важный компонент мембраны - холестерин. До сих пор холестерин можно было пометить только в очень ограниченной степени флуоресцентными красителями, которые можно визуализировать под микроскопом, не повреждая мембрану. Исследователи из Университета Мюнстера (Германия) разработали метод, позволяющий обойти эти трудности. Они синтезировали новый тип соединения, которое обладает свойствами, подобными свойствам холестерина, но которое можно метить красителями и визуализировать в живых клетках. Там соединение реалистично имитирует поведение природного холестерина. «Наш новый подход предлагает огромный потенциал для визуализации динамики мембран в живых клетках», - говорит профессор Фолькер Герке, один из руководителей исследования и координатор Cells-in-Motion Cluster of Excellence. Работа является результатом междисциплинарного исследования с участием химиков-органиков, биохимиков и биофизиков. Исследование опубликовано в текущем выпуске журнала Cell Chemical Biology.
Подробный рассказ
Клетки в организме заключены в своеобразную защитную оболочку - плазматическую мембрану, которая отделяет клетку от окружающей среды. Клетки также содержат внутренние мембраны, которые отделяют отдельные компоненты клетки друг от друга и регулируют перемещение веществ между различными «пространствами». Холестерин, жироподобное вещество, является важным компонентом мембран, обеспечивающим их правильную работу.
Синтез новых соединений
Для создания веществ, которые ведут себя аналогично природному холестерину, исследовательская группа химиков-органиков под руководством профессора Фрэнка Глориуса впервые синтезировала ряд химических соединений. В качестве исходного вещества они использовали природный холестерин, который превращали в некую органическую соль - соль имидазолия. «Из предыдущих исследований мы уже знали, что эти соли хорошо взаимодействуют с биомолекулами и поэтому подходят для клеточных экспериментов», - говорит Фрэнк Глориус, который также руководил исследованием. Чтобы сравнить биофизические свойства вновь синтезированных соединений со свойствами природного холестерина, исследователи включили вещества в синтетические модельные мембраны, состоящие из фосфолипидов (эти фосфолипиды составляют основной компонент мембран). Биохимики и биофизики Кластера передового опыта в группе профессора, доктора Ханса-Йоахима Галла измерили, среди прочего, как новые вещества влияли на температуру фазового перехода модельных мембран и как они изменяли текучесть в фосфолипидном слое при разные температуры. «После оценки данных мы, наконец, остановились на трех соединениях, которые проявляли свойства, очень похожие на свойства природного холестерина», - говорит Лена Рейкерс, аспирант кафедры органической химии и один из двух первых авторов исследования.
Эксперименты на живых клетках
Исследователи выбрали эти соединения, чтобы исследовать их в живых клеточных мембранах, тем самым изучая их в еще более сложных структурах. Для этого они использовали культуры эпителиальных клеток человека - клетки HeLa, а также клетки кровеносных сосудов человека, клетки HUVEC. Благодаря своей структуре вновь синтезированные вещества хорошо вписывались в клеточные мембраны. С помощью поверхностной масс-спектрометрии исследователи измерили молекулы в мембране и смогли показать, что соединения ведут себя очень похоже на естественный холестерин в живых клетках.
Из-за своей структуры одно из новых веществ может быть помечено флуоресцентными красителями. С этой целью исследователи присоединили к веществу азидную группу. Затем они связали красители с этой азидной группой с помощью клик-химии - эффективного метода, позволяющего соединять молекулярные компоненты на основе нескольких химических реакций. Наконец, биохимики визуализировали вещество в живых клетках с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения. Таким образом, они могли наблюдать за его распространением и динамическими изменениями. «Эти анализы также показали, что новое соединение ведет себя аналогично клеточному холестерину», - говорит Дэвид Грилл, аспирант биохимии и другой первый автор исследования. Одним из больших преимуществ нового метода является то, что в течение всего процесса компоненты и свойства клеточной мембраны оставались неповрежденными.
В будущем исследователи хотят продолжить разработку своего метода и протестировать новые вещества в дальнейших клеточных исследованиях с использованием различных методов микроскопической визуализации. Одна из их целей - использовать химию щелчков для присоединения флуоресцентных красителей и других молекул к новым соединениям, чтобы в конечном итоге внести селективные изменения в мембрану.