Новый мир CRISPR
Процесс CRISPR-Cas9 меняет биотехнологию. Но технология все еще находится в зачаточном состоянии. Генные ножницы должны быть более точными и эффективными - и иметь возможность изменять целые геномы одним махом.
Пшеница без глютена? Спасти банан от грибка-убийцы? Тополя, которые быстро растут, несмотря на засуху, высокие температуры и бедную питательными веществами почву, для устойчивого биотоплива?
Требования, которые десять лет назад показались бы совершенно нереальными биохимику Хольгеру Пухте из Технологического института Карлсруэ. Но с момента появления CRISPR-Cas9 исследования в области селекции растений достигли ошеломляющего технического прогресса, написал он в обзорной статье в феврале 2020 года.
Биотехнологический инструмент, разработанный в 2012 году, направлен на то, чтобы сделать сельскохозяйственные культуры еще более полезными для нас, людей. Но на пути к этому нужно преодолеть несколько препятствий - технология не только предлагает большой потенциал для улучшения, эксперты также видят некоторые недостатки. Тем временем, однако, CRISPR находится на пути к тому, чтобы стать долгожданным универсальным инструментом в биотехнологии. Не только в растениеводстве.
Но именно здесь прогресс наиболее заметен. Пучта хвалит метод мультиплексирования как исторический прорыв, который впервые позволяет превратить дикое растение в культивируемое всего за одно поколение растений. Для этого вы одновременно меняете несколько мест в геноме, а не одно.
Селекция растений как пионер
Всего за один шаг ученые смогли вырастить питательный, высокоурожайный и вкусный культурный томат из неприметного исходного растения. Это привлекательно, говорит Пучта, потому что дикие растения обладают естественной устойчивостью, которую вряд ли можно вообразить в одомашненном, генетически обедненном помидоре. «Возможности CRISPR почти безграничны, мы можем очень быстро делать все, что эволюционировало в природе в течение длительного периода времени», - с энтузиазмом говорит исследователь.
Потребность в новых сортах велика. Например, существованию завозимых в Европу бананов все больше угрожает грибок Fusarium oxysporum TR4, уничтожающий целые плантации по всему миру. «Но и не ждите ничего сверхъестественного - CRISPR - часть природы», - добавляет Пучта. «Любая созданная CRISPR устойчивость к патогенам может быть подорвана природой так же легко, как и естественная устойчивость».
Культурные растения должны стать более устойчивыми не только к вредным грибкам, но и к ожидаемым последствиям изменения климата. Проводятся исследования, чтобы сделать их более продуктивными и предложить растущему населению мира с растущими потребностями в энергии новые источники энергии, такие как тополя, в ближайшем будущем.
Принцип, лежащий в основе этого, очень старый. На протяжении тысячелетий люди пользовались тем фактом, что геномы живых существ со временем меняются. В селекции он контролирует это изменение путем селекции: сорта с разными полезными свойствами скрещиваются, чтобы получить новые сорта, сочетающие в себе лучшие черты обоих родителей.
Пропущенная цель
Однако поиск нужных растений занимает много времени. Кроме того, в растения могут попасть непреднамеренно сгенерированные неблагоприятные признаки. Например, томат, выведенный десятилетиями, потерял многие свои вкусовые качества в поисках все более крупных плодов, поэтому современные сорта томатов менее ароматны, чем более старые сорта.
В отличие от этого и от мутагенезной селекции, при которой радиация или химические вещества вызывают случайные повреждения генома, CRISPR позволяет вносить генетические изменения только в отдельные, заранее определенные участки генома растения. Здесь строится специальная РНК, последовательность оснований которой соответствует мишени в геноме.
Это направляет белок Cas9 к выбранному целевому участку в ДНК, где он разрезает обе нити двойной спирали. Естественные механизмы восстановления клетки снова соединяют нить - именно так гены могут быть инактивированы или специально модифицированы. Потому что клетка использует РНК, сконструированную с желаемыми изменениями, для восстановления своего генетического материала на основе этой модели. Он может даже заменить свои укороченные последовательности генов внешней ДНК, если будет добавлена подходящая. РНК деградирует и в клетке не остается чужеродного гена - по мнению специалистов, это одно из решающих преимуществ технологии.
"Но ничего сверхъестественного ожидать не стоит - CRISPR является частью природы" (Хольгер Пухта)
Довольно теории. На практике есть несколько загвоздок. Наиболее важными из них являются так называемые побочные эффекты: непреднамеренные мутации, которые могут возникнуть, когда Cas9 повреждает гены, вырезая неточно или непреднамеренно последовательности генов. Это может привести к ошибкам репарации разрезанной ДНК и, как следствие, к нежелательным мутациям.
Потомки растений с такими нежелательными изменениями в настоящее время должны быть отсортированы. В конце концов, это намного меньше, чем при классической селекции или даже при технической генерации мутаций, - объясняет Пухта. «Конечно, двухцепочечные разрывы также происходят при мутагенезе размножения с радиоактивным излучением».
Уменьшение нежелательных мутаций
Это даже приводит к тысячам нежелательных мутаций по сравнению с несколькими в CRISPR. Естественные мутации также обычно происходят чаще, чем внешние мутации, созданные с помощью CRISPR в обработанных растениях. Например, геномы двух колосьев ржи с одного поля естественным образом различаются по 100 участкам.
Тем не менее, эксперты усердно работают над стратегиями дальнейшего снижения побочных эффектов. К ним относятся, например, более совершенные последовательности РНК, которые приводят генные ножницы к цели. Или разработка методов CRISPR с повышенной специфичностью. Компоненты и технология постоянно совершенствуются, методы усложняются.
Мультиплексирование Puchta на растениях томатов идет дальше, чем усовершенствование отдельных компонентов системы. Изначально применение CRISPR ограничивалось модификацией отдельных генов. Теперь исследователи могут вносить крупномасштабные изменения в геном, обучая CRISPR многозадачности, одновременно вырезая белок Cas9 в нескольких местах в разных белковых последовательностях. Пухта считает этот процесс величайшим достижением зеленой биотехнологии.
Ученые описывают выдающийся успех мультиплексирования при преобразовании дикого растения томата в «Природной биотехнологии». После определения пяти ключевых характеристик одомашнивания - характера роста, формы, размера, количества плодов и качества рациона - они сконструировали пять РНК, соответствующих определенным последовательностям ДНК. Результат: они одним прыжком перешли от дикорастущих растений к овощам.
Пять за один раз
«Используя классические методы селекции, потребовалось много десятилетий, чтобы вырастить дикий томат», - отмечает Габи Крчал, глава AIPlanta, института исследований растений при министерстве земли Рейнланд-Пфальц. «Самое замечательное в CRISPR то, что он быстрый и точный. Но вы должны хорошо знать организм, который хотите изменить. Ограничения CRISPR начинаются там, где есть пробелы в знаниях о геноме организма».
Профессор биотехнологии изучает методы селекции бобов, возможной кормовой культуры. Это предназначено для сокращения импорта сои из-за границы, но для этого бобы должны стать более устойчивыми к грибкам и засухе и давать больший урожай.
Для ее исследования бобов комплекс CRISPR, состоящий из белка, РНК и матрицы для новой генетической нити, вводится в части зрелых семян бобов с помощью бомбардировки частицами. Эти семенные части потенциально могут дать начало новым сеянцам бобов, которые затем будут обладать желаемой мутацией и связанным с ней признаком.
"Ограничения CRISPR начинаются там, где есть пробелы в знаниях о геноме организма" (Габи Крчал)
Таким образом, Cas9 никогда не становится частью растения - он разлагается через относительно короткое время. В другом селекционном проекте в институте Крчала боковые почки тестовых растений опрыскивают комплексом CRISPR. Затем новые боковые побеги будут нести модифицированные цветы, плоды и более поздние семена, из которых вырастут растения с отредактированным геномом - без трудоемкой культуры тканей.
CRISPR в медицине
Этот метод особенно полезен для обработки видов растений, культивирование тканей которых очень сложно или требует много времени, например, древесных растений. Такое «кратковременное» введение CRISPR в растение также может свести к минимуму нецелевые сокращения.
Медицинские специалисты также проводят особенно интенсивные исследования по уменьшению нецелевых эффектов. По словам руководителя лаборатории Ральфа Кюн из Центра молекулярной медицины им. Макса Дельбрюка Ассоциации Гельмгольца, наблюдается тенденция к другому новому методу - базовому редактированию. В этом случае Cas9 больше не используется для разрезания генома; он связывается только с ДНК-мишенью, репарация осуществляется другим ферментом.
Ученый-биомедик Кюн занимается исследованиями в области генной терапии уже три десятилетия. Он говорит, что «потратил» много времени до открытия CRISPR, потому что в течение 20 лет у него были только эмбриональные стволовые клетки, которые он мог использовать для исправления определенных генетических дефектов.
В настоящее время стволовые клетки берутся у пациента с генетическим дефектом, обрабатываются методом CRISPR, а «исцеленные» стволовые клетки повторно вводятся для размножения.
Таким образом, исследователи могут более эффективно лечить заболевания крови, такие как серповидноклеточная анемия, или Кюн и его коллеги, тяжелую врожденную нейтропению 1 типа, по крайней мере, у мышей. Кюн не знает ни одного исследователя генома, который бы не использовал новый биотехнологический инструмент: «Это похоже на Берлинский марафон, все бегут в одном направлении».
Уже существует более 1000 патентов CRISPR, в основном из США и Китая. Исследование «Природная биотехнология» в 2019 году классифицировало 45 процентов всех патентов как общие технические усовершенствования, 27 процентов патентов относятся к медицинскому сектору, 13 процентов - к исследованиям растений.
Будущее: неопределенность
Исследователи растений извлекают выгоду из медицинских разработок, потому что в медицине точность особенно важна. Ножницы могут повредить ген и вызвать рак. Напротив, путь от разработки новых методов CRISPR в исследованиях растений короче. «Внешние эффекты в растениях гораздо менее проблематичны: растения не могут заболеть раком», - говорит Пучта.
До сих пор неясно, будут ли такие исследовательские проекты, в случае успеха, использоваться в Европе: Здесь, согласно решению Европейского суда в 2018 году, каждое растение, обработанное CRISPR, классифицируется как генетически модифицированный организм потому что геномные мутации индуцируются людьми.
Это парадоксально и противоречит научным знаниям, сетует Пухта. «С CRISPR нет повышенного риска. Растения, обработанные редактированием генов, не имеют значительных побочных эффектов, в отличие от растений, обработанных классическим мутагенезом, которые широко используются в сельском хозяйстве уже 70 лет».
Для них закон делает исключение. Из-за их длительного использования мутагенезные растения не подпадают под действие Закона о генной инженерии. Еще неизвестно, приведут ли общеевропейские протесты ученых к изменению этого весьма спорного положения. В любом случае глобальный бум CRISPR продолжается.