БУФФАЛО, Нью-Йорк - Пьеро Бьянко продюсирует фильмы. Не фильмы, рассказывающие о человеческом состоянии, а-ля Голливуд. Его предметом является биология человека в ее самом базовом виде - транслокация и раскручивание ДНК моторным белком ДНК.
Бьянко, доцент Центра биофизики одиночных молекул и кафедры микробиологии, впервые записал на видеопленку в режиме реального времени молекулу того или иного моторного белка ДНК в процессе «разархивирования» двойного нити бактериальной ДНК.
Чтобы совершить этот подвиг, Бьянко использует новую технику, которую он разработал, под названием «лазерный пинцет». Используя этот инструмент, он может схватить и удерживать молекулу ДНК достаточно долго, чтобы зафиксировать действие по мере раскручивания двойной спирали.
«Эти лазерные пинцеты позволяют нам рассматривать одну молекулу за раз и понимать, как на самом деле работает белок», - сказал Бьянко. «Когда вы смотрите на группы белков, все нюансы отдельных белков теряются. С помощью этой системы мы можем вытащить молекулу ДНК из раствора и фактически наблюдать, как одна молекула геликазы ДНК (моторный белок) берет отдельную молекулу ДНК и разбери его."
Если бы была премия Оскар за самый важный фильм о фундаментальной науке, работа Бьянко, несомненно, была бы в ходу. Знание того, как ДНК раскручивается, копирует и восстанавливает себя - что это запускает, останавливает и почему - сделает возможным значительный прогресс в лечении рака и жизненно важно для прогресса генной терапии и исследований рекомбинантной ДНК.
Бьянко в настоящее время фокусирует свое расследование и свою камеру на моторном белке, более сложном, чем тот, который был запечатлен в его первом фильме, и который имеет другой способ действия.
Его цель в UB - снять на видео в режиме реального времени действия нескольких моторных белков, которые выполняют раскручивание и восстановление ДНК, и использовать эти знания, чтобы ответить на насущные вопросы о том, как работают лекарства от рака.
Поскольку рак вызывается неконтролируемым ростом клеток, а моторные белки ДНК делают это возможным, позволяя ДНК копировать себя, моторные белки являются естественными мишенями для лекарств. Исследователи знают, что многие лекарства от рака останавливают рост клеток, но они не знают, как именно. Бьянко надеется предоставить некоторые подробности.
«Мы хотим выяснить, что происходит, когда вы вводите противоопухолевый препарат на пути моторного белка», - сказал Бьянко. «Если лекарство останавливает рост клеток, мы хотим выяснить, как именно оно это делает. Начнет ли белок раскручиваться в присутствии лекарственного средства? Если оно начнется, продолжится ли оно? Где оно остановится, если вообще остановится?» Полученные фильмы покажут, как работают существующие лекарства, и позволят исследователям проверить эффективность новых лекарств, предназначенных для подавления репликации и восстановления ДНК.
Бьянко разработал свою новую систему, будучи научным сотрудником Калифорнийского университета в Дэвисе, в сотрудничестве с коллегами из Ливерморской национальной лаборатории Лоуренса в Ливерморе, Калифорния. журнал Nature, январь 2001 г.
Изучение того, как функционирует моторный белок ДНК, и запечатление его на пленке поставило несколько неприятных технических проблем в то время: как вырвать одну молекулу ДНК, растянуть ее и удерживать достаточно долго, чтобы наблюдать за геликазой в действии.. Затем возникла проблема размера: моторные белки ДНК, называемые геликазами, слишком малы, чтобы их можно было наблюдать под микроскопом.
Бьянко решала эти проблемы разными способами. Лазерный пинцет образует суть системы. Сфокусировав инфракрасный лазерный луч через объектив микроскопа и используя законы физики, он может создать оптическую ловушку, которая остановит молекулу ДНК на ее пути.
Сама по себе молекула слишком неуловима, чтобы ее можно было поймать, поэтому Бьянко привязывает молекулу ДНК к микроскопической шарику из полистирола, чтобы дать пинцету что-то, за что можно схватиться. Затем он прикрепляет молекулу моторного белка к противоположному концу молекулы ДНК и помечает как шарик, так и ДНК флуоресцентным красителем. Краситель создает изображение, достаточно яркое, чтобы его можно было записать микрокамерой, предназначенной для работы в условиях очень низкой освещенности. Ранее не существовало методов связывания флуоресцентного красителя с геликазой ДНК, но теперь у Bianco есть такая возможность в UB.
Растягивание молекулы и инициирование действия происходит в проточной ячейке - крошечном, сделанном на заказ Y-образном устройстве размером с предметное стекло микроскопа. Бьянко вводит шарик и его груз ДНК и моторного белка в один канал проточной ячейки (одно из плеч Y), вводит АТФ - источник молекулярной энергии - в другой канал, фокусирует оптический микроскоп и лазерный луч на стыке каналов.
Вытянутая молекула и ее источник энергии текут по своим отдельным каналам в место соединения, где и начинается действие. Лазерный луч захватывает шарик полистирола пинцетообразным захватом. Управляя лазерным лучом, Бьянко направляет ДНК на путь АТФ, который запускает геликазу.
Прорывной фильм, описанный в журнале Nature, показывает молекулу хеликазы Escherichia coli, называемую RecBCD, которая действует, расстегивая молекулу ДНК с одного конца на другой. В этом фильме показано, как растянутые нити светящейся ДНК становятся все короче, поскольку невидимый двигательный белок расстегивает их, вытесняя краситель по мере его движения.
Это действие называется процессивной транслокацией. На пленке это выглядит как череда ламп, которые выключаются один за другим.
Как только нити ДНК разделены, могут начаться элементарные процессы репликации или восстановления.
В UB Бьянко адаптирует свою новую систему для исследования других, более сложных бактериальных геликаз. Настоящей целью является RuvB, кольцевая наномашина, которая запускает критический последний этап генетической рекомбинации, называемый миграцией ветвей. В отличие от RecBCD, этот моторный белок обвивается вокруг ДНК, как пончик на веревке, выполняя транслокацию другим способом. Установка UB оснащена двумя оптическими ловушками и значительно более продвинута, чем его предыдущая система, что позволяет ему работать со сложными молекулами, такими как RuvB.
Главной целью исследования Бьянко является изучение того, как лекарства от рака мешают транслокации, что, в свою очередь, позволит разработчикам лекарств нацеливать химиотерапевтические препараты на наиболее эффективную точку процесса. Он намеревается определить и заснять действие нескольких моторных белков, а затем начать работу с четырьмя специфическими противораковыми препаратами, предоставленными сотрудниками Института рака Розуэлл-Парк.
«Здесь есть потенциал, - сказал Бьянко, - чтобы ответить на вопросы, на которые вы никогда не смогли бы ответить никаким другим способом».