Новый микроскоп, изобретенный учеными из исследовательского кампуса Janelia Farm при Медицинском институте Говарда Хьюза, позволит исследователям использовать чрезвычайно тонкий слой света, аналогичный тому, который используется в сканерах штрих-кода в супермаркетах, чтобы заглянуть внутрь отдельных живых клеток, обнаруживая трехмерные формы клеточных ориентиров с беспрецедентной детализацией. Техника микроскопии создает изображения с высокой скоростью, поэтому исследователи могут создавать великолепные фильмы, оживляющие биологические процессы, такие как деление клеток.
Техника, называемая микроскопией плоскостного освещения Бесселя, описана в исследовательской статье, опубликованной в Интернете 4 марта 2011 года в журнале Nature Methods.
Главной целью биологов является понимание правил, управляющих молекулярными процессами внутри клетки. Если кто-то пытается изучить правила игры, лучше иметь фильм о людях, играющих в игру, чем неподвижные фотографии - и то же самое верно для клеток, - говорит руководитель группы Janelia Farm Эрик Бетциг. Он изобретает и совершенствует микроскопы уже более 30 лет. Несмотря на огромные успехи в микроскопии за это время, Бетциг говорит, что эта область все еще затруднена тем фактом, что многие методы микроскопии требуют, чтобы клетки были убиты и зафиксированы в положении для визуализации. Изучая мертвые клетки, он говорит, что это эквивалент неподвижных фотографий.
Бетциг хотел создать микроскоп, который позволил бы исследователям увидеть динамическую внутреннюю жизнь живых клеток. Идея изучения живых клеток, пронизанных флуоресцентно меченными белками и другими молекулами, не нова. Но методы с живыми клетками могут быть проблематичными, потому что свет, излучаемый микроскопами, со временем может повредить клетку. Помимо повреждения клеток, свет заставляет флуоресцентные молекулы, которых очень мало, со временем гаснуть. Другими словами, чем дольше вы изучаете клетку, чтобы раскрыть ее свойства, тем больше вреда вы наносите клетке и тем больше вероятность того, что вы израсходуете свой «фотонный бюджет», - говорит Бетциг.
Более того, свет микроскопа освещает большую часть образца, а не только небольшую часть, которая находится в фокусе. Освещение областей вне фокуса приводит к размытию, из-за чего небольшие внутриклеточные особенности выглядят как удлиненные пятна, а не как острые точки. «Вопрос заключался в том, есть ли способ свести к минимуму количество наносимого вами ущерба, чтобы вы могли затем изучать клетки физиологическим способом, а также изучать их с высоким пространственным и временным разрешением в течение длительного времени?» Бетциг говорит.
Задолго до прибытия на ферму Джанелия в 2006 году Бетциг начал думать о способах улучшения микроскопии живых клеток. Он отложил эти мысли и сосредоточился на разработке новых методов микроскопии, которые в конечном итоге разрушили бы пределы пространственного разрешения (налагаемые законами дифракции). До недавнего времени микроскопы могли видеть объекты размером не менее 200 нанометров. Несколько лет назад Бетциг и его коллега по ферме Джанелия Харальд Хесс изобрели фотоактивируемую локализационную микроскопию, PALM, которая позволяет получать изображения объектов размером всего 10-20 нанометров.
PALM и большинство других микроскопов - даже те, которые студенты колледжей используют на уроках биологии - работают, экспонируя образец через одну линзу объектива, а затем собирая свет, возвращающийся через ту же линзу. Такой подход приводит к тому, что свет повреждает образец и вызывает размытие, что затрудняет наблюдение за живыми клетками.
В 2008 году Бетциг начала работать над решением этих проблем. Одна из его идей заключалась в том, чтобы использовать микроскопию с плоским освещением. Плоское освещение, впервые предложенное около 100 лет назад, заключается в освещении листа света сбоку от образца, а не сверху. Для этого микроскописты используют два разных объектива, которые расположены перпендикулярно друг другу.«Поскольку вы идете сбоку, плоское освещение ограничивает возбуждение намного ближе к той части, которая находится в фокусе», - говорит Бетциг.
Хотя другие исследователи, в том числе научный сотрудник Janelia Farm Филипп Келлер, с большим успехом использовали плоскостное освещение для изучения многоклеточных организмов размером в сотни микрон, световые листы все еще были слишком толстыми, чтобы эффективно работать для визуализации отдельных клеток размером всего в десятки микрон. размером микрон. Основная проблема заключается в том, что широкая полоса света, используемая при плоскостном освещении, обнажает большую часть клетки, чем того хотела группа Бетцига. Это вызвало чрезмерное размытие и светотоксичность. Чтобы обойти эту проблему, его группа использовала луч Бесселя, особый тип недифрагирующего светового луча, изученный физиками в конце 1980-х годов и используемый сегодня в приложениях, включая сканеры штрих-кода в супермаркетах. Его группа обнаружила, что перемещение луча по образцу создает более тонкий световой слой.
Бесселевские пучки ведут себя немного странно, и это то, что занимало постдокторских исследователей Бетцига - Томаса Планшона и Лян Гао - в течение последних нескольких лет. Хотя они производят очень узкий световой пучок, лучи Бесселя также создают несколько более слабый свет, который окружает фокальную точку, делая рисунок освещения похожим на мишень. Дополнительные легкие лепестки являются помехой, потому что они возбуждают слишком большую часть образца. Чтобы компенсировать эту проблему, группа Бетцига использовала два приема. Первая - это концепция, называемая структурированным освещением, в которой вместо того, чтобы непрерывно перемещать луч, они включают и выключают его быстро, как при стрельбе из пулемета. Это создает периодическую решетку возбуждения, которую можно использовать для устранения размытия вне фокуса. (Структурированное освещение, используемое руководителем группы ферм Janelia Матсом Густафссоном, также является одним из способов достижения сверхвысокого разрешения.)
Другой стратегией, используемой группой Бетцига, является двухфотонная микроскопия, метод, обычно используемый в неврологии для визуализации толстых кусочков мозговой ткани. Одним из преимуществ двухфотонных микроскопов является то, что очень слабый сигнал флуоресценции генерируется в слабо экспонированных областях. Таким образом, при применении двухфотонных методов фон от боковых лепестков Бесселя был устранен, и остался только свет от узкой центральной части пучка Бесселя.
Затем они как можно быстрее отправляются на съемку. Луч Бесселя быстро проходит через образец, позволяя группе делать около 200 изображений в секунду и создавать трехмерные стопки из сотен двумерных изображений за время от одной до 10 секунд. Как они и надеялись, они обнаружили, что могут делать сотни таких наборов трехмерных изображений, не повреждая клетку, создавая удивительные фильмы о клеточных процессах, таких как митоз, когда хромосомы делятся, когда одна клетка становится двумя. «Нет никакой другой техники, которая могла бы приблизиться к изображению такой длины с такой высокой пространственной и временной детализацией», - говорит Бетциг.
Прошлым летом, как только они получили свои первые изображения живых клеток, Бетциг, Планшон и Гао упаковали новый прибор в арендованный внедорожник и отвезли его в Морскую биологическую лабораторию Вудс-Хоул в Массачусетсе для физиологического исследования. курс, где они работали с соавторами Джимом и Кэти Гэлбрейт из Национального института здоровья.«Мы многое узнали о том, что работает, а что нет, и о способах лечения клеток таким образом, чтобы поддерживать их физиологическое состояние во время визуализации», - говорит он. «Как и любой микроскоп, инструменты - это только часть головоломки. Во многом это поиск правильных образцов и правильных методов подготовки, чтобы заставить его работать».
Новый микроскоп интересен еще и тем, что в будущем его можно будет использовать для улучшения микроскопии сверхвысокого разрешения. PALM и другие методы сверхвысокого разрешения ограничены просмотром тонких мертвых образцов и могут быть очень разрушительными при просмотре живых образцов. «Вот что действительно хорошо в Бесселе - мы можем ограничить это возбуждение и действительно начать думать о применении микроскопии сверхвысокого разрешения для изучения структуры или динамики в более толстых клетках», - говорит Бетциг. По словам Бетцига, даже без суперразрешения микроскопия с плоскостным освещением Бесселя станет мощным инструментом для клеточных биологов, поскольку она неинвазивно отображает быстро развивающуюся трехмерную сложность клеток.
Видео можно посмотреть по адресу: